随着我国水产养殖业的持续不断的发展, 环境安全问 题越来越严重, 不合理的排放和药物的滥用加剧了 对环境的污染。
生物絮团技术不仅能降低养殖 水体中的氨氮和亚硝酸盐等无机氮含量, 还能促 进养殖对象的生长, 提高饵料利用率和存活率。
碳氮比是指养殖水体中有机碳源和各种含氮物质 质量的比值, 是影响生物絮团形成的主要的因素。
已 有的研究表明, 水中的碳氮比达到15时就能产生絮 团, 分泌胞外酶等活性物质, 促进异养微生物转化 吸收养殖水体中的无机氮。
日本沼虾(俗称青虾)隶属长臂虾科(Palaemo nidae), 沼虾属(Macrobrachium), 是我国重要的淡水 养殖虾类之一, 因其肉质鲜美, 具有较高的经济价 值。
根据2018年中国渔业统计年鉴显示, 全国日本 沼虾年产量超过2.7×108kg。
鉴于碳氮比是生 物絮团形成的重要因素, 因此本研究以日本沼虾 为研究对象, 研究不同碳氮比对生物絮团形成以及 对日本沼虾生长、肠道消化酶和肝胰腺抗氧化酶 活性的影响, 为日本沼虾的健康养殖提供新的思路。
实验用虾取自大浦养殖基地(119°55′23″E, 31°18′47″N)。先将日本沼虾暂养在室内的水缸中 (30 cm×40 cm×100 cm, 120 L), 暂养1周稳定后, 将 初始体重为(0.25±0.03) g健康且规格一致的日本沼 虾放入水缸中, 每缸50尾。
养殖周期50d, 每天投喂 两次(9:00和15:00), 日投喂量为体重的5%—8%。 对照组每天换水1/3, 实验组实行封闭式零换水养 殖, 因采集水样和蒸发损失的水能够直接进行补充。
养 殖期间水温25—28℃, pH7.4—8.4, 溶氧大于6 mg/L。 每天对日本沼虾的生长情况做观察和记录。
以葡萄糖为碳源 , 实验组按照不同碳氮比 10(C/N10组)、15(C/N15组)、20(C/N组)和25(C/ N25组)添加碳源, 对照组不添加碳源, 每组设置三 个重复。
按照Avnimelech得出的生物絮团技术所 需碳源计算公式根据确定各处理组添加葡萄糖的 量分别是投喂饲料量的1/3、1/2、2/3和5/6。
样品收集 在养殖过程中, 每7d取1次水样, 立 即带回实验室用于氨氮(NH4+ -N)和亚硝酸盐氮 (NO2- -N)的测定;
在养殖实验结束后, 禁食24h后取 样, 计数并称重, 每个缸取5只日本沼虾, 获取完整 的肝胰腺和肠道, 用液氮速冻后, 于–80℃冰箱保存。
在肝胰腺和肠道解冻后, 称取组织 重量, 在冰浴条件下, 使用电动匀浆机匀浆, 按照 1：9的比例把组织与生理盐水混合制成浓度为 10%的组织匀浆液, 温度4℃, 转速3000 r/min, 离心 10min, 取出上清液用于相关酶活指标的测定。
淀 粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、谷胱甘肽还过氧化物 酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定均使用购 自南京建成生物工程研究所的试剂盒, 酶活单位为 酶量(U/mg)。
将水样过滤后, 采用 纳氏试剂分光光度法测定水体中氨氮(NH4+ -N) 的浓度; 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定水体中 亚硝酸氮(NO2- -N)浓度。
采集水样后均匀混合, 抽滤待 测水样, 滤膜烘干称重测定总固体悬浮物(TSS)。
另取1 L混合好的水样倒入英霍夫锥形瓶中直至刻 度线min, 待水样中悬浮物完全沉淀 后, 观察沉淀物所在的刻度线, 此即为单位水体中 生物絮团的体积 , 记录絮团体积。
式中, Wt和W0分别表示日本沼虾的终末平均重量和 初始平均重量, t为养殖周期, N0和Nt分别表示日本 沼虾的终末存活尾数和初始放养尾数, 重量单位 为克(g)。
各个指标测出的数据用SPSS19.0做多元化的分析, 先 进行单因素方差分析(ANOVA), 如差异显著进行 Duncan多重比较, P0.5表示差异显著, 数据结果以 平均值±标准误(Mean±SE)表示。
各组的氨氮和亚硝酸盐含量在前4周呈升高趋 势, 在第4周达到高峰; 第4周以后对照组和C/N10组的氨氮和亚硝酸盐含量持续升高而C/N15组、C/N20组和C/N25组呈下降趋势(图 1), 并逐渐保持稳定。
在不同碳氮比条件下, 生成的生物絮团含量不 同。养殖实验初期, 由于絮团产生还不稳定, 各组 含量在第2周有略微下降;
第3周开始, 生物絮团产生的量明显上升, 随后的4周保持稳定, C/N20组的生物絮团含量最高(图 2)。
通过肉眼观察水体以及对比滤纸发现, C/N20 组的养殖水体呈棕褐色, 且颜色最深, C/N20组抽滤 出的固体悬浮物最多(图 3)。
在400倍显微镜下观 察生物絮团可发现丝状菌、小席藻、轮虫、舟形 藻、有机物和微囊藻等组成成分(图 4)。
生物絮团的形成主要靠水体中异养微生物的 快速繁殖, 而微生物的生长繁殖最主要营养元素是 碳和氮;
由图 2可知, 在C/N 20组中,养殖水体颜色呈棕褐色, 生物絮团形成的效果最好,生物絮团体积和总固体悬浮物均高于其他处理组。
有研究表明, 碳氮比不同, 生物絮团产生的时 间、效果和作用机制也不一样, 因此维持适宜的碳 氮比对生物絮团的产生至关重要。
生物絮团可有效调节水质, 降低水体中三氮水平, 在实际生产中, 对水产经济动物造成了严重的伤害的主要是氨氮和亚硝酸盐, 在本研究中, C/N 15组和C/N 20组的氨氮和亚硝酸氮浓度明显低于对照组和其他处理组。
邓 吉朋等的研究发现适宜的碳氮比能保证良好的 水质, 但不同的是, 碳氮比越高水质越好。
这与本 研究中C/N 25组的结果有差异, 原因可能是物种和 养殖过程上不同。
生物絮团是一种富含多种营养成分的絮状物,其中含有35%—50%的粗蛋白和2.5%—9%的粗脂肪, 能量达到18—22 kJ/g, 能够作为虾类的潜在饵料。
图 3证明了生物絮团含有多种组成成分, 包 括轮虫和原生动物等, 其营养成分保证了日本沼虾 的生长。
刘杜鹃等在罗氏沼虾(M. rosenbergii) 育苗的实验中, 证明了向养殖水体中添加碳源, 提 高碳氮比有利于罗氏沼虾仔虾的生长, 提高出苗 率。
李京昊等应用生物絮团技术养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii), 碳氮比维持在15以上时,在减少投喂的情况下, 实验组克氏原螯虾的生长并没有受一定的影响,而在本研究中, 碳氮比的升高对日本沼虾的生长有显著影响, 在碳氮比20时, 生物絮团含量最多且该组的日本沼虾的生长性能明显高于其余各组。
这表明生物絮团对日本沼虾的生长起到了推动作用。这原因是产生的生物絮团含有的营养成分更易被日本沼虾消化吸收, 也有一定的可能生物絮团中存在某些具有促进生长的活性物质。
超氧化物歧化酶(SOD)在预防生物损伤, 减少 自由基方面具备极其重大作用, 谷胱甘肽过氧化物 酶(GPX)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物 分解酶, 是评价抗过氧化能力的重要指标之一。
在 本研究中C/N20组日本沼虾的SOD明显高于其他组 (P0.5)。这表明该组的日本沼虾有更强的抗自由 基能力, 保证了日本沼虾的健康生长。
这与生物絮 团在克氏原螯虾中的研究结果相似。在本研究 中, 从C/N15组开始, GPX有显著提高; 这与凡纳滨 对虾(L. vannamei)的研究结果相似 ;
但区别在于,凡纳滨对虾(L. vannamei)的GPX在碳氮比15时活性最高, 而日本沼虾的GPX在碳氮比20时活性最高,这或许是物种之间的差异造成的。
也有报道认为, 不仅是生物絮团中的微生物刺激了免疫机能的提 升, 还有某些营养的东西提高了机体的抗氧化水平, 而碳氮比的高低影响了生物絮团的形成和其营养 成分, 因此维持适宜的碳氮比对于提升养殖对象的 抗氧化水平十分重要。
在本研究中, 相比对照组, C/N20组的日本沼虾SOD和GPX的显著提高, 其具 体作用机制还需进一步研究。
生物絮团能够提升水生动物的消化能力。淀 粉酶能水解糖原和淀粉, 有利于养殖动物对糖类营 养物质的吸收。
在本研究中, C/N20组的淀粉酶活 性明显高于其他组。这与Wang等的研究结果相 似。
但葛海伦等在罗氏沼虾的研究中发现, 生物 絮团并没有提升罗氏沼虾肠道淀粉酶的活性。
可 能是因为培养生物絮团的碳源不一样, 导致絮团组 成成分有所差异, 其发挥的作用也略有差别。
脂肪 酶能将甘油三脂水解, 促进肠道的吸收。在本研究 中, C/N20组的脂肪酶明显高于其他组, 证明了碳氮 比20时, 生物絮团能够明显提高日本沼虾肠道中的 脂肪酶活性。
徐武杰的研究表明, 生物絮团显著 了提高了凡纳滨对虾(L. vannamei)的脂肪酶活性, 促进了凡纳滨对虾对脂肪的消化吸收。
在克氏原 螯虾和罗氏沼虾的研究中, 均证明了生物絮团 能明显提升脂肪酶活性。
胰蛋白酶是一种蛋白水 解酶, 是评价虾类生长和营养状况的重要指标之 一。
在本研究中C/N20组的胰蛋白酶活性非常明显升高, 这与凡纳滨对虾、罗氏沼虾和克氏原螯虾的研究结果一致。
观察发现, 日本沼虾有摄食生物絮团的现象, 而已有的研究表明生物絮团确实含有淀粉酶、脂 肪酶和胰蛋白酶等消化酶, 故推测日本沼虾通 过摄食生物絮团增加了肠道内的消化酶含量。
消 化酶含量的提高意味着机体消化能力和代谢水平 的提高 , 这有利于日本沼虾的生长发育。
然而, 在碳氮比较低时产生的生物絮团较少, 甚至没有生 物絮团产生, 所以日本沼虾无法摄食足够的絮团提 升消化水平。
结合生物絮团形成规律并根据图 2比较各组水体颜色和固体悬浮物含量并可知, C/N20组的生物絮团含量最多, 这与各组消化酶活性的变化规律以及日本沼虾的生长规律相一致。
因此, 适 宜的碳氮比是形成絮团的重要条件, 也是促进日本 沼虾生长和提高消化酶活性的重要因素。
本研究根据结果得出, 在日本沼虾养殖过程中, 维持碳氮比20可有效形成生物絮团, 降低水体氨氮和亚硝酸盐浓度, 提高日本沼虾的生长指标、抗氧酶和消化酶活性。
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